Pintura que representa al santo según su iconografía tradicional, barbado, con tonsura y vestido con hábito pardo. Aparece arodillado, disponiéndose junto a él la calavera alusiva a sus reflexiones sobre lo transitorio de la vida mundana. Contempla San Francisco la aparición del serafín de Dios que marcaría en él los estigmas de Cristo. Para la disposición de la figura del santo, el pintor ha seguido el grabado de la Estigmatización de San Francisco realizado por Cornelis Cort sobre composición de Girolamo Muziano. Es una representación que forma pareja con la otra visión extática presente en este retablo, la visión de Cristo crucificado por San Agustín. La presencia de ambas pinturas en el retablo, no directamente relacionadas con la iconografía mariana del mismo, pudo deberse a devociones particulares de los comitentes del conjunto. Le respalda un hermoso paisaje, seguramente extraído de algún grabado, que muestra una clara influencia de la pintura nórdica, con pequeñas masas boscosas y montes, de tonos verdosos y azulados. Dicha influencia nórdica es igualmente apreciable en aspectos como el rígido dibujo y el tratamiento de la indumentaria del santo. Aunque ha sido vinculada por algunos investigadores a Francisco Pacheco, se considera actualmente obra anónima, próxima al estilo de Vasco Pereira.
